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Intestine and Microbe on a Chip

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IP  162.105.60.137

Posted at 2018-1-13 17:55:49 | All floors |Read mode
Microfluidic, Intestine, Microbe, Cancer, immunity……

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 Author| Posted at 2018-1-21 15:46:10 | All floors
Last edited by 张嵩元 In 2018-1-21 15:47 Editor

团队信息
(队长) 盛   南    CQB    2017级博士研究生 单细胞测序数据聚类分析
             隋秀文    CQB    2016级博士研究生 神经生物学
             方臻成    CQB    2015级博士研究生 生物信息学
             晓   娜    CQB    2016级博士研究生 神经生物学   
             张嵩元  生科院   2016级本科生       探索中...   

             主题:微流控芯片

虽然没有任何一位成员的研究方向是微流芯片,但初生牛犊不怕虎,新人更敢想像,不同的思想更容易碰撞出思维的火花!
我们希望借这次机会从理论上初步了解微流芯片,开拓思维,大胆提出自己的创意~~~

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 Author| Posted at 2018-1-21 16:14:09 | All floors
Last edited by 张嵩元 In 2018-1-21 17:03 Editor

初识
时间:2017.12.17
地点:老化学楼101(动员会)
内容:
1.互相认识彼此
2.神经生物学方向的组员提出把神经元做成玩具,在芯片中搭建神经网络:
在芯片中特定分化神经元(先铺一层胶质细胞起支持作用在加入干细胞诱导分化),让特定的细胞之间形成形成突触联系。
但大家都不了解干细胞分化以及人工定向诱导突触形成的方法。

开始对微流芯片知识的学习与探索...



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 Author| Posted at 2018-1-21 17:02:50 | All floors
Last edited by 张嵩元 In 2018-1-21 17:08 Editor

第一次讨论
时间:2017.12.23
地点:老生物楼316
内容:
1. 交流微流芯片知识的学习成果
微流控芯片的一些应用方向:检测与诊断,实验室技术(电泳、PCR),模拟真实生物系统(器官芯片等)...
微流控芯片的优点:微流的特殊性质,样品用量少,高通量,便于创造特定微环境...
2. 提出一些idea
基于上次芯片上构建突触网络的idea,我们找到了一篇报道
“New microfluidic chip replicates muscle-nerve connection”
进而找到了原文献
[size=13.3333px]Uzel S G, Platt R J, Subramanian V, et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units[J]. Science Advances, 2016, 2(8):e1501429-e1501429.
MIT的研究团队在微流芯片上构建了神经肌肉突触并用神经控制肌肉
于是我们进一步提出设想:
用微流控制作一条完整反射弧,包含感受器、传入神经、中枢、传出神经、效应器;
结合新报道的人工血管构建方法,我们在其中加入神经层,可以制作可以人工控制舒张和收缩的血管;
利用微流芯片上的微通道,定向诱导轴突、树突形成和伸长,在特定位置实现突触连接,从而构建有功能的神经环路比如生物钟;
构建学习记忆模型
...
...

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 Author| Posted at 2018-1-22 03:47:15 | All floors
第八次讨论
时间:2018.1.21
地点:综合科研楼5层咖啡室
内容:
1. 答辩ppt思路梳理、分工、制作
2. 利用芯片进行研究”模块的细化
受芯片上构建糖尿病肾病模型(见之前帖子)启发,我们打算研究膳食纤维影响肠道免疫的机制:
肠道免疫分多个模块:
共生菌;
粘液层;
上皮细胞;
免疫细胞;
...
膳食纤维调节肠道菌群吗?
膳食纤维通过肠道菌群等途径调节粘液层厚度吗?(有些肠道微生物可以调节粘液层)
膳食纤维改变上皮细胞之间的紧密连接吗?
膳食纤维直接作用于杯状分泌细胞吗?
膳食纤维能否增强某种免疫细胞的功能?
...

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Posted at 2018-1-21 20:58:43 | All floors
张嵩元 Posted at 2018-1-21 15:46
团队信息
(队长) 盛   南    CQB    2017级博士研究生 单细胞测序数据聚类分析
             隋秀文     ...

快做最后的报告了,好紧张

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 Author| Posted at 2018-1-21 19:03:32 | All floors
Last edited by 张嵩元 In 2018-1-21 19:04 Editor
张嵩元 Posted at 2018-1-21 17:02
第一次讨论
时间:2017.12.23
地点:老生物楼316


第二次讨论:
时间:2017.12.29
地点:老化学楼三层会议室
内容:
1. 继上次的idea深入讨论
考虑体外微流控构建由神经控制收缩舒张血管的应用前景:
i. 移植如体内
可以作为置换体内受损血管实现疾病治疗;
可以在其中加入“感受器”元件实时测量血液流速与粘度情况;(但考虑如今体外测量血压等指标的技术已经很先进了)
更高级一些将反射环路置于其中实现其对血压等的适应与调控;
体外控制血管管径(如心梗或血栓发作时用体外装置控制神经舒张血管)
...
ii. 体外建立血管模型
研究血液流动的性质;
血栓模型;
但血栓模型如“[size=13.3333px]Tsai, M., Kita, A., Leach, J., Rounsevell, R., Huang, J. N., & Moake, J., et al. (2012). In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation,[size=13.3333px] 122[size=13.3333px](1), 408.”已经较为清楚简洁
...
主要问题是体外构建具有真实的复杂层次结构的血管过于复杂,不知如何用微流控实现。
本次讨论进展较小

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 Author| Posted at 2018-1-22 00:26:28 | All floors
第三次讨论
时间:2018.1.4
地点:老化学楼三层会议室
内容:
1. 汇报体外构建人工神经控制可舒缩血管的调研情况
中科院国家纳米中心蒋兴宇组的人工血管新进展“Cheng, S., Jin, Y., Wang, N., Cao, F., Zhang, W., & Bai, W., et al. (2017). Self-adjusting, polymeric multilayered roll that can keep the shapes of the blood vessel scaffolds during biodegradation. Advanced Materials, 29(28).”利用微流芯片技术先将血管各层的细胞按顺序一块一块地平铺在一中基质膜上,然后把它卷起来就实现了血管各层的结构的构建。我们只需加一层神经细胞层,再与肌肉细胞层形成突触就可以实现控制
2. 新idea之一
在“Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., & Kamm, R. D. (2012). Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(34), 13515-20.”中,作者模拟了肿瘤细胞穿过内皮细胞的过程,在此启发下,我们想到了新idea:
在微通道中模拟血液流动,通道后面的去十中接上不同组织器官的区室,模拟肿瘤细胞在不同器官之间的转移。
3. 新idea之二(大反转)
突然想到了近几年来兴起的,目前热门的肠道微生物研究,结合目前微流控芯片领域较为热门的“organ-on-a-chip”方向,我们对共培养肠道微生物的小肠模型起了兴趣。
找到了一篇文献“Shah, P., Fritz, J. V., Glaab, E., Desai, M. S., Greenhalgh, K., & Frachet, A., et al. (2016). A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human–microbe interface. Nature Communications, 7, 11535.”

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 Author| Posted at 2018-1-22 00:47:08 | All floors
Last edited by 张嵩元 In 2018-1-22 00:49 Editor

第四次讨论
时间:2018.1.5
地点:综合科研楼四层会议室
内容:
1. 准备明天的开题答辩,做出了一个伟大决定:“将我们的设计方向转向肠道芯片”,分工做ppt
2. 继续研读文献
我们找到了上次英文文献在中国工程院院刊《Engineering》上的翻译版本“人体胃肠道–菌群相互作用的工程学研究模型”
仔细研究后发现作者提出的芯片模型过于简单,只研究了小肠上皮细胞与菌群间的相互作用,因此只构建了两层细胞,小肠上皮Caco-2细胞与共生E. coli,并在中间加了隔断,未能真实反映肠道状态,而且采用的是平铺单层Caco-2细胞,并未创造出立体形态,而且采用的是将细菌与上皮细胞分别浸在低氧高氧培养液的策略,这样以来氧非常容易渗透入菌层。
所以我们提出了一下构建方法:
1. 构建真实的粘液层结构以实现天然的、可以“隔空喊话”、允许适度相互接触的隔离
2. 利用血管供给养分与氧气
3. 实现具有绒毛结构表面形态以及更多层复杂的组织层次
我们还找到了发表在《jove》上的另一篇肠道模型文献“Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., & Ingber, D. E. (2016). Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. J Vis Exp, 2016(114).”
做出了极不符合真实情况的“绒毛”结构但依然存在前一个模型的缺陷

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 Author| Posted at 2018-1-22 01:00:12 | All floors
张嵩元 Posted at 2018-1-22 00:47
第四次讨论
时间:2018.1.5
地点:综合科研楼四层会议室

[size=13.3333px]边做ppt边调研时我们发现:
[size=13.3333px]在肠芯片尚未完全成熟时竟有体外重建小鼠小肠的报道!
[size=13.3333px]Kitano, K., Schwartz, D. M., Zhou, H., Gilpin, S. E., Wojtkiewicz, G. R., & Ren, X., et al. (2017). Bioengineering of functional human induced pluripotent stem cell-derived intestinal grafts. Nature Communications,8[size=13.3333px](1).
[size=13.3333px]这篇文章残忍地剪下一段健康的小鼠小肠,利用SDS等物质使之脱细胞化,成为只含基质一个可供细胞生长的scaffold。然后利用可诱导多能干细胞灌注,在特定分化因子作用下成功“着陆”,形成“有功能”的“人工小肠”,这样保留了绒毛结构,并证明具有吸收功能,然后接回抑制患肠病而切除一段小肠的小鼠体内,成功存活(用移植受体小鼠的干细胞诱导就不会出现排异反应)。
[size=13.3333px]此项工作名不副实,并没有太体现tissue engineering,本质只是重做了一次干细胞分化。
[size=13.3333px]但此项工作为我们提供了一个思路,干细胞诱导多样的肠上皮细胞技术已经存在,我们可以利用干细胞诱导的方法构建小肠上皮

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 Author| Posted at 2018-1-22 02:11:58 | All floors
第五次讨论
日期:2018.1.13
地点:综合科研楼四层会议室
内容:
针对老师对我们草率的开题报告给出的建议,我们打算从两方面改进我们的项目
1.改进我们新型肠道芯片
在报告会上老师提到了3D打印,我们计划对此进行深度调研
2. 利用肠道芯片做一个小研究
虽然我们知道肠道菌群很热门却不知现在的研究进展如何
于是我们先纵览了最近肠道菌群热门文章,然后从中寻找适宜利用我们芯片进行得研究
例如:

年度巨献:肠道微生物组重磅级研究TOP20解读
http://www.biotech.org.cn/information/1520982017

其中有许多是研究肠道微生物与抑郁症或者其他器官的影响,并不是很适合我们的芯片装置

我们筛选了如下一些:

上皮细胞与T细胞的交流调节对细菌侵染的反应Hoytema van Konijnenburg DP, Reis BS, Pedicord VA, et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 2017 Nov 2;171(4):783-794.e13. doi: 10.1016/j.cell.2017.08.046

Wenhan Zhu, Maria G. Winter, Mariana X. Byndloss et al. Precision editing of the gut microbiota ameliorates colitis. Nature, Published online: 03 January 2018, doi:10.1038/nature25172

共生菌抗癌DOI:10.1126/science.aac4255
Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti–PD-L1 efficacy

共生菌影响癌症免疫疗法的效率DOI:10.1126/science.aad1329
Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota

William O. C. M. Cookson et al. New opportunities for managing acute and chronic lung infections, Nature Reviews Microbiology (2017). DOI: 10.1038/nrmicro.2017.122

Moving beyond microbiome-wide associations to causal microbe identification
doi:10.1038/nature25019

Improving regulation of microbiota transplants
doi:10.1126/science.aaq0034

Science:肠道微生物决定着食物对肠道的影响
doi:10.1126/science.aag2770

Science:重大发现!在肠道上皮内,罗伊氏乳杆菌诱导促进耐受性的T细胞产生
doi:10.1126/science.aah5825
Lactobacillus reuteri induces gut intraepithelial CD4+CD8αα+ T cells

Science:揭示膳食纤维如何有助肠道保持健康
doi:10.1126/science.aam9949; doi:10.1126/science.aao2202

Nature:肠道菌群分泌药物分子可调节肠道与免疫系统健康
doi:10.1038/nature24661

Cell:揭示肠道微生物组与自身免疫疾病存在关联
doi:10.1016/j.cell.2017.09.022

这使我们关注肠道模型的几个方向:免疫、癌症、营养吸收...涉及了共生细菌、肠上皮细胞、免疫细胞、癌细胞等的相互作用
免疫引起了我们最广泛关注,因为共培养细菌难免让人想到肠道如何应对细菌侵染,共生菌在其中起作用吗?而且我们提出构建粘液层,粘液层的作用如何?

在中文综述的指导下,我们继续进行深度调研:
【1】解文放, 左玉, 李庆伟,等. 动物肠道菌群与宿主肠道免疫系统相互作用的研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2017(11).
【2】高侃, 汪海峰, 章文明,等. 益生菌调节肠道上皮屏障功能及作用机制[J]. 动物营养学报, 2013, 25(9):1936-1945.

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 Author| Posted at 2018-1-22 02:39:54 | All floors
第六次讨论
时间:2018.1.16
地点:综合科研楼五层
内容:
1. 3D打印在微流芯片中的应用
并不能实现一个细胞一个细胞地打印,大多用某种基质材料打出特定的形状,或者用3D打印含有细胞的墨水。
3D打印血管的美妙工作可以应用到我们的设计中!

2. 新型3D肠道芯片的具体构建方法
i. 如何在其中构建血管和淋巴管
参见Kolesky D B, Homan K A, Skylar-Scott M A, et al. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(12):3179.
ii. 如何制造绒毛结构
几篇可以借鉴的文章
Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., & Ingber, D. E. (2016). Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. J Vis Exp, 2016(114).
Kim, S. H., Chi, M., Yi, B., Kim, S. H., Oh, S., & Kim, Y., et al. (2014). Three-dimensional intestinal villi epithelium enhances protection of human intestinal cells from bacterial infection by inducing mucin expression. Integrative Biology, 6(12), 1122-1131.

3. 应用此芯片进行研究具体方向的探讨
三位小组成员分别提出了三种想法,并展开了激烈讨论:

张嵩元:免疫细胞与菌群相互作用。利用自下而上的思维方式从我们芯片的创新点入手,构建出的淋巴管和血管是免疫细胞的来源,并且可以观察免疫细胞迁移,内皮基质中也存在多种免疫细胞。研究表明免疫细胞会从上皮细胞钻出清除钻过粘液层的细菌...

盛南:在肠道中培养特定的一些益生菌,通过通入不同组分的营养液给出不同营养环境,模拟不同饮食习惯(例如高脂饮食、高糖饮食、膳食纤维等),加入致病菌,观察肠道对致病菌的免疫情况。

隋秀文:微流肠道模型研究肠道微生物对药物吸收的影响 首先是要做更逼真的肠道 要有绒毛扩大表面积 然后下面要有血管状通道在下面模拟吸收情况  加上微生物 筛选出吸收好的一类药。

讨论结束后发起线上投票。

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 Author| Posted at 2018-1-22 02:44:22 | All floors

小肠结构图1,显示了其复杂的免疫系统

小肠结构图2,显示了绒毛、血管、淋巴管、上皮、内皮等构造,上述结构反映在我们的芯片中

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 Author| Posted at 2018-1-22 02:49:26 | All floors
张嵩元 Posted at 2018-1-22 02:39
第六次讨论
时间:2018.1.16
地点:综合科研楼五层


探讨小肠模型的结构

学习文献中3D打印带血管组织的具体方法
(第五次讨论)

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 Author| Posted at 2018-1-22 03:11:05 | All floors
题外话:
除了肠芯片模型,其他的器官模型如何呢?

分享一篇肾小球芯片的模型


Wang L, Tao T, Su W, et al.A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice.Lab Chip. 2017 May 16
这篇文章亮点有二,都值得我们的项目借鉴:
1. 将球状的肾小球模型抽象为平面结构,成功模拟了其中的多种细胞以及结构:肾表皮细胞、足细胞、肾小囊等。
2. 将此模型应用于糖尿病肾病的研究中
利用高糖溶液灌注,并观察了高糖环境对如下指标的影响:
表皮细胞紧密连接;
表皮细胞糖转运蛋白表达;
ROS的产生;
支持上皮细胞的足细胞的迁移(导致上皮细胞不稳定,滤膜结构便脆弱)
得出结论,高糖会导致肾小球通透性增高,从而导致蛋白尿等症状。
(提供了一个应用自己芯片做研究验证自己芯片性能够好的例子)

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 Author| Posted at 2018-1-22 03:17:39 | All floors
第七次讨论
时间:1月18日
地点:老化学楼3层会议室
内容:
一、  如何将肠道模型的微流芯片落到实处
新型小肠模型芯片制作工序
1.        准备工作
1)        小肠绒毛模具的制作
精细加工PDMS制作正模,PDMS模具灌注可降解海藻酸钠材料制作反模。
图2 小肠绒毛模具制作与使用
2)        3D打印墨水配制
血管墨水(vascular ink):Pluronic F127-DA,凝血酶等。
细胞承载墨水(cell-laden ink):明胶,纤维蛋白原,基质细胞(成纤维细胞等),基质细胞培养液等。
细胞外基质材料:明胶,纤维蛋白原,转谷氨酰胺酶等。
3)        多种细胞培养灌流液的配制
血管上皮细胞培养液,淋巴管上皮细胞培养液,诱导分化成肠细胞的多能干细胞培养液
2.        3D打印血管淋巴管结构及基质细胞基础
将血管墨水与细胞承载墨水分别以所需的立体管网状打印在芯片上,血管及淋巴管网与各自的进、出液口相连。
3. 将制备好的海藻酸钠基小肠绒毛模具置于管网上方
4. 浇铸胞外基质材料并“冷却”
将细胞外基质材料从模具下方通入,覆盖血管淋巴管网并充满绒毛模具。等待血管墨水中的凝血酶扩散至基质材料中,与转谷氨酰胺酶共同作用与纤维蛋白原作用使之形成交联的纤维蛋白网络,胞外基质材料固化。
5.灌注血管淋巴管
利用Pluronic F127-DA的特性在4℃时使之液化并排空,得到管状空腔。利用血管上皮及淋巴管上皮细胞培养液灌注此空腔分别得到血管/淋巴管网络。培养液的渗透作用同时为基质细胞提供营养。经过一段时间,血管/淋巴管上皮细胞贴壁生长形成管壁,基质细胞增殖逐渐填满基质。(在各组分稳定形成后以特定养分及充足氧浓度的营养液灌注血管模拟血液流动。以特定淋巴细胞培养液灌流淋巴管模拟淋巴液)
6.小肠上皮形成
在模具上方利用海藻酸钠基模具的溶胶液使模具融化,并以干细胞培养液灌流。细胞开始将聚集在陷窝中逐渐分化增殖直至形成单层上皮布满绒毛表面。
7. 粘液层形成
继续培养,加入特定刺激因子,控制流速使粘液层稳定形成
8. 共生细菌培养
通入低氧浓度的细菌培养基模拟肠腔微环境,选择特定共生菌或组合使之在粘液层中定居。
9. 模型形成情况评估
利用多种染色方式检测细胞存活情况,紧密连接形成情况,粘液层形成情况等。可事先构建荧光蛋白标记的各种细胞,利用共聚焦显微镜技术重构模型的三维结构。

二、项目书分工写作

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 Author| Posted at 2018-1-22 03:27:59 | All floors
张嵩元 Posted at 2018-1-22 03:17
第七次讨论
时间:1月18日
地点:老化学楼3层会议室

精彩文献分享:
如何3D打印带血管的组织
参考文献:
[size=13.3333px]Kolesky D B, Homan K A, Skylar-Scott M A, et al. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(12):3179.

3D打印技术;
性能超级奇特的墨水材料:Pluronic F127-DA 打印出的一刹那由于剪切力液化,打出来后变为固体,在4℃时可以液化排空从而形成血管空腔;
双酶法:凝血酶与转谷氨酰胺酶作用于纤维蛋白原使之形成交联的纤维蛋白网络(似凝血的过程)
...
佩服作者的奇妙想像!

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 Author| Posted at 2018-1-22 03:32:17 | All floors
体外肠道模型的发展历程:从2D到3D,从一种细胞到多种细胞,微流芯片化...
肠道的3D模型有两种含义:
1. 多层次的细胞可以叫3D;
2. 卷成桶装可以叫3D;
3. 表面凹凸绒毛结构可以叫3D;(个人倾向于这种,前面是伪3D)

2D:
最早的只有单层上皮细胞Hidalgo, I.J. et al. (1989) Characterization of the human colon carcinoma cell line
(Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology
96, 736–749
共培养Caco-2和HT29-MTX简单研究通透性Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX Co-cultured Cell Lines:
Permeabilities Via Diffusion, Inside- and Outside-Directed
Carrier-Mediated Transport


上皮细胞与免疫细胞共培养A Three-Dimensional Coculture of Enterocytes,
Monocytes and Dendritic Cells To Model Inflamed
Intestinal Mucosa in Vitro

共培养Caco-2和HT29-MTX杯状细胞增加粘液分泌量A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable
permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding
procedure(2014)


3D:
无绒毛结构:
空心圆柱内层小肠上皮外层成纤维细胞In vitro enteroid-derived three-dimensional
tissue model of human small intestinal
epithelium with innate immune responses
Caco-2和U937免疫细胞共培养模拟肠道免疫屏障Characterization of tight junction disruption and immune
response modulation in a miniaturized Caco-2/U937
coculture-based in vitro model of the human intestinal
barrier
上皮细胞和共生细菌A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestial human-microbe interface
共生细菌对病原菌侵袭的减弱作用co-culture of epithelia cells and bacteria for investigating host pathogen interactions

有绒毛结构:
利用液流使Caco-2细胞长成绒毛形态并分化Gut-on-a-Chip microenvironment induces human
intestinal cells to undergo villus differentiation
较真实小肠绒毛建立并证实绒毛形态促进上皮细胞功能Three-dimensional intestinal villi epithelium enhances protection of human intestinal cells from bacterial infection by inducing mucin expression


脱细胞基质上重培养:
Bioengineering of functional human induced
pluripotent stem cell-derived intestinal grafts


挑的是比较有代表性的。

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Posted at 2018-1-22 11:58:21 | All floors
Last edited by Shengn In 2018-1-22 12:03 Editor

芯片结构1.0
直接在芯片中用肠上皮干细胞分化出多种肠上皮细胞,生成黏液层。
在上皮下部增加毛细血管结构,模拟真实小肠,为肠细胞提供养分和氧气。


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Posted at 2018-1-22 12:13:34 | All floors
芯片结构2.0

增加肠绒毛结构,增加毛细血管和毛细淋巴管。

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