膜电位作为重要的生理指标，其动态变化反映了神经元、心肌细胞和胰岛细胞等可兴奋细胞复杂多样的电生理状态。荧光膜电位探针，可以单细胞分辨、高检测通量地实现细胞电信号的可视化记录分析。然而，大多数膜电位探针对细胞动作电位呈现“负向响应”，即：探针荧光信号随细胞去极化而降低，而在细胞处于静息状态时亮度较高。由此在生物组织成像中面临更严重的背景干扰和光漂白问题。为了降低膜电位成像中的荧光背景，亟需发展静息态更暗、去极化变亮的“正向”膜电位探针。
2025年8月8日，北京大学化学与分子工程学院邹鹏课题组、未来技术学院陈知行课题组、定量生物学中心的汤超课题组共同在Science Advances杂志在线发表了他们最新的研究成果“Positive-going hybrid indicators for voltage imaging in excitable cells and tissues”。他们通过膜蛋白工程化改造和生物正交化学标记手段，逆转了“负向探针”对膜电位响应的极性，开发出了正向响应的复合型探针HVI+（图1）。其中，HVI+搭配高亮度橙色荧光染料Cy3b，对100 mV膜电位变化展现出55%ΔF/F0的灵敏度，成为目前最灵敏的正向橙色膜电位探针，可以精确刻画神经元和心肌细胞所产生的动作电位的波形。此外，HVI+还可以与负向探针HVI联用，同时记录胰岛中两类细胞的电活动。
邹鹏课题组长期致力于发展检测细胞生命活动的化学探针，率先提出“复合型膜电位探针”的概念，即：通过生物正交化学标记策略，实现化学荧光染料与视紫红质蛋白偶联，构建膜电位荧光探针。该探针以电致变色原理灵敏、迅速指示细胞膜电位变化（Angew. Chem. Int. Ed. 2018; Nat. Chem. 2021）。此外，课题组早在2019年就提出了工程化改造视紫红质蛋白以获得正向响应的设计与实践（ACS Chem. Neurosci. 2019）。陈知行课题组致力于根据化学原理量身定制化学荧光分子，解决荧光成像中亮度低、光毒性高、光稳定性差等问题（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2023；Nat. Methods 2025）。汤超课题组对胰岛等器官中的细胞振荡机理与调控有着浓厚兴趣和深入认识，为此发展了稳定可控的成像技术平台、图像分析算法和数学模型，对胰岛复杂的生理活动进行测量、分析和模拟（Nat. Metab. 2024）。
在最新的研究成果中，课题组共同合作，首先对视紫红质Ace2质子供体D92和质子释放位点E199先后进行突变筛选，改变视黄醛席夫碱的质子平衡，从而逆转探针对膜电位响应的极性；随后利用连接酶介导的化学标记和逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应，将挑选出的高荧光量子产率的橙色四嗪染料Tetrazine Cy3b引入工程化改造的视紫红质蛋白的特异位点（图1）；最后利用探针观测了胰岛中不同浓度的葡萄糖对α和β两类细胞群体电活动的调控作用。
图1 正向响应的复合型膜电位探针HVI+响应原理概念图
在膜电位成像过程中，膜电位信号幅度和形状可能会受到细胞形变、迁移以及药物处理的干扰，这种干扰在跳动的心肌细胞中格外明显，因此需要对膜电位信号进行形变校正。常规校正方式是共表达或与融合表达一个参比荧光蛋白，然而共表达方式无法保证膜电位探针与参比膜定位水平一致，探针末端融合荧光蛋白可能会直接损害探针原本的膜定位。
于是作者设计了一种HVI+探针专属的比率成像策略：对表达HVI+的心肌细胞用环辛四烯（cyclooctatetraene, COT）修饰的Cy3和Cy5混合染料进行标记。其中，HVI+搭配橙色染料COT-Cy3对膜电位敏感，而搭配深红色染料COT-Cy5几乎没有膜电位响应，因此Cy5通道的信号可作为细胞形变校正的参比。该方法保证了两种染料在细胞膜上的定位与比例一致。使用COT修饰的四嗪染料还可以有效减缓光漂白并降低成像过程带来的心肌毒性。
双通道同时成像结果表明，形变对心肌细胞不同区域的荧光信号造成了不同程度的畸变，不同区域的参比通道甚至出现相反的信号变化，难以仅凭Cy3通道直接分离出膜电位信号。经过Cy5通道的校正后，心肌细胞各区域的信号比值高度相似，并观察到心肌细胞形变略滞后于动作电位的产生（图2）。由此展现出HVI+比率膜电位成像对跳动心肌细胞成像的必要性和有效性。
图2 HVI+克服形变干扰对跳动心肌细胞进行膜电位记录
正向膜电位探针除了具备更好的光稳定性和更低的背景干扰外，还具备与负向膜电位探针联用的特性。即便二者使用了相同的成像通道，它们的电信号可通过响应极性区分开，从而实现细胞类型的鉴定。如此，仅用单一荧光通道即可同时对两类细胞进行膜电位观测。
于是作者观察了葡萄糖水平对胰岛α和β细胞电活动的调节作用，他们通过腺病毒侵染手段分别将HVI和HVI+探针表达在胰岛α和β细胞中，同时观测它们在3mM和13mM葡萄糖培养环境下动作电位产生的频率变化。根据成像结果，在具有旁分泌环境的完整胰岛中，3mM至13mM的葡萄糖浓度的转换能够可逆地显著激活β细胞；而在相同条件下，α细胞电活动变化具有很强的异质性，作者在这些胰岛中观察到了葡萄糖对α细胞的抑制和兴奋双重作用（图3），该现象与α细胞胰高血糖素分泌所呈现的U型葡萄糖浓度响应应曲线相一致。
图3 HVI与HVI+联用观测葡萄糖对小鼠胰岛α和β细胞动作电位发放频率的调控作用
总之，本文进化得到了新一代具有正向响应的复合型探针HVI+，并将其应用于可兴奋性细胞和组织的膜电位成像。时至今日，我们对胰岛等组织的电生理异质性以及细胞之间的相互作用的理解仍然有限，近年来的一些研究对该领域的若干经典理论发起了挑战并给予了新的诠释。期待该探针能在神经和胰岛电活动记录中启发研究者产生更新、更深入的见解。
北京大学化学与分子工程学院的刘书彰博士，北京大学前沿交叉学院的凌靖博士（现UC San Diego博士后），北京大学前沿交叉学院博后（现未来技术学院助理研究员）谢北辰博士为该论文的共同第一作者。北京大学邹鹏研究员、陈知行研究员和汤超教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、北京分子科学国家研究中心和北大-清华生命科学联合中心的资助。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ads1807
