从热力学观点看，生命系统是处于非平衡态的开放系统，需要物质的输入与能量的消耗来维持其稳态和有序性。在生物系统的研究中，人们通常在具体的生化反应中研究ATP水解反应的化学能是如何供给生命活动和特定生物功能的1, 2。例如，细胞通过耗能来降低酶促反应的错误率（动力学校对）3, 4、提高生化开关的敏感性2, 5、维持生物钟分子振荡的同步化6, 7等。从水解自由能和细胞内ATP水平角度，对于生命现象系统层次上的作用的定量研究，还是比较缺少8。近期，北京大学李方廷/欧阳颀团队以胰岛β细胞中钙振荡为研究对象，通过建立动力学模型的方式研究了细胞内ATP水平和ATP水解自由能在钙振荡系统当中的调控作用。论文于2022年11月28日发表在美国物理学会（APS）旗下期刊Physical Review Research上9。
图1 外界糖浓度刺激下，胰岛细胞钙振荡系统的示意图。(a)细胞内ATP水平影响膜上离子通道的开闭，从而决定钙振荡是否发生。(b)针对外界不同糖浓度刺激，胰岛细胞通过糖酵解、氧化磷酸化等过程改变胞内ATP水平与自由能水平。 |
钙振荡对生理活动的调节广泛存在于人体的各类细胞当中，如心肌细胞、神经细胞、胰岛β细胞等等。不同细胞中钙振荡所承担的调控功能也不相同，同时钙振荡模式的复杂性也体现了其功能的多样性。钙振荡是胰岛β细胞响应葡萄糖刺激、分泌胰岛素的通路中的关键环节。如图1所示，β细胞受到外源葡萄糖的刺激，线粒体中糖代谢加剧，提高了细胞内ATP浓度；ATP又作用于细胞膜上的离子通道系统，使得细胞膜去极化，最终导致钙振荡的产生10；钙振荡的信号最终作用于含胰岛素的囊泡的分泌11。通常认为钙振荡的失效是II型糖尿病的重要病因12。在β细胞中，ATP主要通过两种方式对钙振荡进行调控：一方面，ATP同ATP调控的钾离子通道（the ATP-sensitive K+ channels, KATP）结合可以使通道关闭，并使膜电位去极化，以此触发钙振荡；另一方面，ATP水解为钙离子泵（Plasma membrane Ca2+ ATPase, PMCA）供能，使得钙振荡能够得以维持。
本论文主要包括两个部分。（1）考虑细胞膜上离子通道系统，构建钙离子-膜电压的两变量模型（图1a），ATP水平和水解自由能作为参数输入，重点考察了水解自由能如何影响高频钙振荡的触发条件。（2）进一步考虑糖代谢过程，构建糖酵解-钙离子模型（图1a和1b），讨论不同糖浓度下钙信号的响应机制。通常情况下，胰岛β细胞钙振荡的定量模型基本以Hodgkin-Huxley模型为范本，并以受ATP调控的钾离子通道KATP和钙离子泵PMCA为代谢产物ATP的作用位点，并且包含了糖代谢过程与膜上离子输运过程13。在本研究工作中，将钙离子泵的反应写成了可逆形式，以便讨论自由能的变化和ATP 的水平对胰岛β细胞钙振荡的影响2。
图2 在不同的细胞内ATP 浓度（[ATP]）和ATP 水解自由能（γ）条件下的钙振荡状态。 |
在本论文的第一部分中，研究者利用两变量模型，讨论了钙振荡是否发生依赖于输入的[ATP]以及水解自由能。这一部分所讨论的钙振荡皆为周期为几秒的高频钙振荡。本论文中用γ代表水解自由能水平，一摩尔ATP水解释放的能量为
Keq为ATP水解反应的平衡常数。研究结果表明，通过改变参数[ATP]和γ可以使钙振荡系统从稳定态转变为振荡态。用非线性物理学的语言描述就是说系统发生了相变或者“分叉”。图2b-c展示了二维的[ATP]和γ的参数空间中，系统达到稳定后，钙振荡的振幅与频率；其中单一的深蓝的的区域是稳定态区域，也就是没有振荡产生的区域；而其他的有颜色的区域则表示存在钙振荡的区域。其振幅或频率的数值分别由其颜色表示。就振幅而言，振荡区的振幅几乎维持不变，然而振荡区的频率在边界处会有明显的下降。而振荡区和非振荡区两个区域的边界就是之前所说的 “分叉”发生的地方。
研究者又分别考察了[ATP]和γ在钙振荡分叉过程中的作用。对于[ATP]来说，在保持不变的情况下，系统会在一定范围内的[ATP]参数下发生振荡。在[ATP]由低浓度逐渐增加的过程中，首先ATP使ATP调控的钾离子通道KATP关闭，导致膜电位的去极化，使得钙振荡产生。但是当ATP浓度过高之后，膜电位无法恢复，因此振荡便无法维持。接下来考察γ的影响。在不同的γ的影响下，分叉点的位置也会发生改变。在图2(b-c)中标注的Case 3-I 和Case 3-II，分叉边界分别向两个不同的方向弯曲。也就是说，分叉点关于γ的关系也是不同的。
为了进一步解释分叉边界的弯曲，研究者对离子通道模型进行了进一步的量化分析。
图3 离子通道受[ATP]和γ的影响。（a-c)[ATP]和γ 作用于KATP通道之上，产生了弯曲的分叉边界。(d-f)PMCA作为消耗ATP水解自由能的通道，决定了分叉边界的下边界。
|
在Case 3-I和Case 3-II，也就是满足γ2 (≈ 107)< γ < γ1(≈ 1011)的位置，分叉点随γ变化的关系并不相同。分叉边界的这种弯曲事实上根源是KATP的开放概率受γ的影响的改变。这种开放概率在模型当中被量化为θ。图3(a) 展示了θ受γ和不同ATP浓度的调控。在γ的生理数值附近(γ≈1010) ，KATP通道的开放概率被大幅提高了。这在图3(b)当中得到了进一步证明。该图展示了通道开放概率θ在[ATP]和的二维参数空间的大小变化。因为在生理浓度附近KATP通道的开放概率增加，因此需要更高的ATP浓度将这个通道关闭掉。在Case-3 I当中和Case-3 II当中，分叉边界的弯曲方向和KATP的开放概率在这些区域内的变化趋势是吻合的。这两个区域当中，分叉边界的弯曲都是出自同样的原因。然而其引起的效果却是相反的。在Case-3 I当中，更低的能量使得触发钙振荡变得更加困难，然而在Case-3 II当中结果反了过来。值得注意的是，生理条件下的值是落在Case-3 I当中。因此有理由相信Case-3 I代表的情况，也就是更低的能量造成钙振荡发生困难的情况，是符合生理条件的情况。
研究者继续考察了细胞膜上的钙离子泵PMCA是如何消耗自由能以进行逆浓度梯度的主动运输的。通过计算可以获知，在满足γ >γ3 ≈ 108的范围内，PMCA几乎不受到的影响。因为在这个范围之内对于PMCA来说，与ATP水解相耦合的反应几乎是不可逆的。然而，当γ小于γ3以后，ATP水解自由能对PMCA的影响效果开始变得十分显著了。JPMCA和自由能的关系展示在图3 (e)当中。其中JPMCA表征通过PMCA的钙离子流。可以看到在较高的情况下JPMCA确实几乎不受的影响，而在γ < γ3 ≈ 108的范围内，PMCA的功能受自由能的影响非常大。这里面，PMCA的反应需要被看成是可逆反应。除此之外，还存在一个最小的值，γ4 ≈107。这个值是钙振荡产生的最小自由能。也就是说，如果自由能低于γ4那么钙振荡就不会产生。可以通过理论计算的方法去估算γ4的量级。理论计算得到的最小值和模型模拟得到的最小值基本一致。
图4 不同糖浓度下诱导的钙离子振荡。(a-b)三种钙离子振荡模式（Type）和对应[ATP]响应。(c) 实验中被观测到模型预言的Type2钙振荡行为。（d）不同[ATP]与γ轨迹诱导下游的高频钙振荡（橙色），灰色为两变量模型预测的高频振荡区。
在本论文的第二部分中，为了理解胰岛β细胞如何响应不同糖浓度刺激，研究者结合两变量模型与糖酵解过程（图1），构建了糖酵解-钙信号模型。通过数值模拟（图4），发现了三种钙信号振荡模式（Type）：Type 1和Type 2中，存在周期为几分钟的[ATP]慢振荡，ATP带动下游钙离子浓度进行慢振荡；同时，Type 1在峰值处、Type 2在上升和下降沿，均存在高频钙振荡，周期为秒量级；对于Type 3，它的[ATP]保持稳定，而下游保持高频钙振荡。结合两变量模型的[ATP]-γ相图结果（图2c），研究者解释了三种钙振荡信号的产生机制：随着糖浓度升高，其诱导的[ATP]-γ轨迹与高频钙振荡区有更多重叠，重叠区域有高频钙振荡产生；[ATP]-γ轨迹最终成为稳定点落在高频振荡区域内（图4d）。值得注意的是，研究者发现的Type2钙振荡，在前人理论模型中基本没有讨论，而小鼠实验中却观测到该振荡行为14（图4c）。
许多研究证明KATP通道蛋白的突变会造成胰岛β细胞胰岛素释放异常，这是2型糖尿病的主要病因之一15，研究者基于糖酵解-钙离子模型，解释了KATP突变如何影响胰岛β细胞对不同糖浓度刺激的钙响应。Tarasov等人发现部分2型糖尿病患者存在KATP通道蛋白的Y356C突变，并且该突变会降低ATP关闭KATP通道的能力，进一步影响下游钙信号和膜电位的响应强度16。图5中，研究者首先拟合野生型和突变株KATP通道的打开概率与[ATP]关系曲线；进一步计算发现，突变诱导[ATP]-γ空间中的高频钙振荡区域向右上移动，使得相同糖浓度下，[ATP]-γ轨迹与高频振荡区相交部分减少或完全消失（图5b）；因此，KATP突变导致相同糖浓度刺激下，高频钙振荡和膜电压振荡减少或消失，即平均钙响应减弱（图5c和5d），可能导致下游胰岛素释放异常。
图5 野生型与SUR1-Y356C突变的KATP通道。(a)突变抑制ATP关闭KATP通道的能力，实线为模型拟合，点为实验结果。(b)突变导致钙离子高频振荡区向右上移动。（c-d）突变导致下游高频振荡时间减少与平均膜电位响应减弱。
综上，本论文通过建立动力学模型的方式研究ATP水解自由能对钙振荡的调控作用，利用[ATP]-自由能相图研究了胰岛β细胞在不同糖浓度刺激下的三种钙响应机制，并分析了2型糖尿病中KATP通道蛋白突变如何导致胰岛β细胞响应异常。研究者认为本论文的模型构建与分析方法有助于未来研究其他离子通道系统的热力学特性。
在审稿过程中，审稿人对本论文结果提出较高评价。部分审稿意见如下：审稿人（1）：“I believe that reproducing the experimental results of WT and the Y356C mutant with a single model is very important achievement. I am sure that this work adds a lot of new knowledge in the area of Biophysics, since it addresses a problem from various angles (kinetics, thermodynamics & energy).”审稿人（2）：“The two-stage analyses provide a clear picture on calcium oscillations and the roles of hydrolysis and glycolysis.”
北京大学物理学院、定量生物学中心李方廷副教授为论文的通讯作者。北京大学物理学院孙运生和李典杰为共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金等机构的支持。
参考文献：
1. Hill TL. Free energy transduction and biochemical cycle kinetics, 1989 edn. Springer: New York, NY, 2012.
2. Qian H. Phosphorylation energy hypothesis: open chemical systems and their biological functions. Annu Rev Phys Chem 2007, 58: 113-142.
3. Hopfield JJ. Kinetic proofreading: a new mechanism for reducing errors in biosynthetic processes requiring high specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 1974, 71(10): 4135-4139.
4. Bennett CH. Dissipation-error tradeoff in proofreading. Biosystems 1979, 11(2-3): 85-91.
5. Tu Y. The nonequilibrium mechanism for ultrasensitivity in a biological switch: sensing by Maxwell's demons. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105(33): 11737-11741.
6. Cao Y, Wang H, Ouyang Q, Tu Y. The free energy cost of accurate biochemical oscillations. Nat Phys 2015, 11(9): 772-778.
7. Zhang D, Cao Y, Ouyang Q, Tu Y. The energy cost and optimal design for synchronization of coupled molecular oscillators. Nat Phys 2020, 16(1): 95-100.
8. Yang X, Heinemann M, Howard J, Huber G, Iyer-Biswas S, Le Treut G, et al. Physical bioenergetics: Energy fluxes, budgets, and constraints in cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2021, 118(26): e2026786118.
9. Sun Y, Li D, Ni C, Ge Y, Qian H, Ouyang Q, et al. ATP hydrolysis kinetics and thermodynamics as determinants of calcium oscillation in pancreatic β cells. Phys Rev Research 2022, 4(4).
10. Wilson DF, Cember ATJ, Matschinsky FM. The thermodynamic basis of glucose-stimulated insulin release: a model of the core mechanism. Physiol Rep 2017, 5(12): e13327.
11. Trexler AJ, Taraska JW. Regulation of insulin exocytosis by calcium-dependent protein kinase C in beta cells. Cell Calcium 2017, 67: 1-10.
12. Barker CJ, Li L, Köhler M, Berggren P-O. β-Cell Ca(2+) dynamics and function are compromised in aging. Adv Biol Regul 2015, 57: 112-119.
13. Félix-Martínez GJ, Godínez-Fernández JR. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets 2014, 6(3): e949195.
14. Beauvois MC, Merezak C, Jonas J-C, Ravier MA, Henquin J-C, Gilon P. Glucose-induced mixed [Ca2+]c oscillations in mouse beta-cells are controlled by the membrane potential and the SERCA3 Ca2+-ATPase of the endoplasmic reticulum. Am J Physiol Cell Physiol 2006, 290(6): C1503-1511.
15. Pipatpolkai T, Usher S, Stansfeld PJ, Ashcroft FM. New insights into KATP channel gene mutations and neonatal diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol 2020, 16(7): 378-393.
16. Tarasov AI, Nicolson TJ, Riveline J-P, Taneja TK, Baldwin SA, Baldwin JM, et al. A rare mutation in ABCC8/SUR1 leading to altered ATP-sensitive K+ channel activity and beta-cell glucose sensing is associated with type 2 diabetes in adults. Diabetes 2008, 57(6): 1595-1604.
