近年来，肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性肠病等免疫紊乱相关疾病的发病率持续攀升，其发病机制与适应性免疫应答的空间组织异常密切相关。T细胞受体（T cell receptor，TCR）和B细胞受体（T cell receptor，BCR）作为介导抗原特异性免疫应答的核心分子，其克隆进化与空间分布直接决定了免疫系统对自身或外来抗原的识别与应答模式。然而，现有空间免疫组库技术受限于分辨率不足、富集引物偏好性、或仅能捕获单一受体类别等技术瓶颈，难以在单细胞分辨率下原位解析T/B细胞克隆动态及其与局部微环境的互作关系。
近日，北京大学定量生物学中心曾泽贤团队联合华大生命科学研究院冯驭团队、香港中文大学周京颖团队，在Nature Communications期刊上发表了题为Uncovering ectopic GC-like niches for tumor reactive lymphocyte priming in lung adenocarcinoma using Stereo-XCR-seq的研究论文。该研究开发了全新的空间免疫组库测序技术Stereo-XCR-seq，首次在华大基因亚细胞分辨率空间转录组Stereo-seq平台上实现了高通量、无偏捕获、单细胞分辨率的TCR/BCR原位测序。利用该技术，该研究构建了首个肺腺癌单细胞分辨率空间免疫组库“地图”，成功揭示了肺腺癌中异位生发中心样微环境调控肿瘤反应性淋巴细胞应答的全新机制。
技术突破：从"看得见"到"看得清"的空间免疫组库解析
在技术层面，现有空间免疫组库测序面临三重挑战：第一，TCR/BCR转录本中V(D)J区域与空间条形码的物理距离超过1000 bp，远超常规短读长测序的覆盖能力；第二，TCR/BCR转录本在空间转录组cDNA文库中丰度极低（<0.01%），对检测灵敏度要求极高；第三，现有免疫组库捕获方法多依赖于已知V基因序列靶向引物或杂交探针，存在富集偏好性且效率有限。为攻克上述难题，研究团队设计了创新的sscirPCR（single-strand circular cDNA PCR）策略：通过将双链cDNA热变性后快速退火为单链，并通过寡核苷酸连接形成单链环状cDNA，通过设计靶向TCR/BCR恒定区（Constant region）的特异性引物进行无偏好性扩增，获得空间条形码与V(D)J分布于序列两端的Stereo-XCR-seq富集文库，最终通过短读长测序实现高保真、高灵敏度的克隆型检测。sscirPCR策略可以实现所有TCR/BCR 相关基因序列的有效富集，Stereo-XCR-seq技术目前可以实现单张切片上千种克隆型捕获。
现有空间免疫组库技术分辨率多为100 μm（如Spatial VDJ、SPTCR-seq），研究团队通过技术参数对比发现，100 μm下所能捕获T/B淋巴细胞数与该区域下真实细胞数存在显著差异，粗分辨率下的免疫组库分析存在克隆扩增定量失真及配对链无法精准匹配等问题，而Stereo-XCR-seq技术通过整合ssDNA染色与CellBin2细胞分割算法，实现了真正的单细胞分辨率空间免疫组库解析，可以提供更真实的TCR/BCR克隆大小与计数。本文中，研究团队展示了Stereo-XCR-seq技术在解析B细胞克隆扩增、体细胞高频突变（Somatic hypermutation，SHM）和类别转换重组（Class switch recombination，CSR）克隆活动中的空间分辨能力，通过在同一空间视野中追踪IgH克隆家族的亚克隆分化轨迹，呈现了肺腺癌组织原位B细胞谱系发育的完整时空图景。除此以外，Stereo-XCR-seq技术不仅适用于新鲜冻存组织样本，在石蜡包埋回顾性临床样本上也具有技术兼容性，将空间免疫组库研究从基础研究推向临床转化。
科学发现：肿瘤未成熟三级淋巴结构的异位生发中心样微环境
三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures, TLS）是肿瘤基质中异位形成的淋巴样聚合体，其成熟程度与免疫治疗响应密切相关。然而，临床数据显示仅少数肺腺癌患者存在成熟TLS，限制了其作为生物标志物的应用价值。研究团队利用Stereo-XCR-seq技术对11例仅含未成熟TLS（immature TLS, iTLS）的肺腺癌样本进行深度解析发现，尽管iTLS内缺乏CD23⁺次级滤泡结构，但B细胞在迁出iTLS后于远端基质形成浆细胞富集区（Plasma cell zone, PCZ），这种异位生发中心样微环境主要在IgM+ PCZ 发生SHM（高表达AICDA），IgG+ PCZ 则富集肿瘤反应性T细胞克隆（高表达TNF、TCF7、FASLG等效应功能基因），T细胞通过CD40LG-CD40互作促进B细胞的CSR和终末分化，两者共同扮演典型生发中心的明暗区结构，重现了肿瘤中的经典生发中心反应，这样的结构特征可能为不含有成熟三级淋巴结构的肿瘤患者提供了新的免疫治疗靶点与机制。
Stereo-XCR-seq的技术优势使其具备广泛的疾病适用性，研究团队目前已在肺腺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、自身免疫性肝炎、类风湿关节炎等多种疾病组织中验证了其应用稳定性。在转化医学层面，Stereo-XCR-seq为细胞治疗提供了关键技术支持，其单细胞分辨率下的配对TCRα/β链回收能力，可直接为TCR-T细胞疗法提供抗原特异性受体序列；对B细胞SHM和CSR的原位解析，则为抗体药物发现提供了高通量筛选平台。Stereo-XCR-seq的技术革新标志着空间免疫组学研究进入单细胞精度、配对链捕获、无偏富集、新鲜样本与石蜡样本兼容的新发展阶段，该技术将T/BCR序列精准定位至分割后的单个细胞，为克隆扩增提供了精确定量依据，并支持微小淋巴样聚集体中解析淋巴细胞克隆活动，为理解免疫应答的空间组织规律提供了全新工具。
原文链接：https://www.doi.org/10.1038/s41467-026-75405-x
